【知识点】从茨维特到现代：高效液相色谱法（HPLC）的应用

这篇推文将对高效液相色谱法（HPLC）做一个简单的介绍，让初步接触液相色谱知识的人员有一个资料进行阅览，如果有不严密的地方请包涵。

色谱法是一种利用物质的溶解性、吸附性等理化性质将混合物分离成不同组分的方法。这涉及到固定相（固体或附着在固体上的液体）和流动相（液体或气体）。流动相流经固定相，并携带混合物中的成分，与固定相相互作用较强的样品成分通过色谱柱的速度比相互作用较弱的成分慢；这种速度上的差异会导致各种成分的分离。色谱法按流动相和固定相的状态分为气相色谱、液相色谱、薄层色谱、凝胶色谱、超临界流体色谱等。

液相色谱法的历史可以追随到20世纪初期。1906年俄罗斯的科学家茨维特（Tswett）为了分析从植物叶子中提取的色素，把溶解了植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗。因为是玻璃管，所以可以清楚地观察管中的情况。随着时间的推移，色素从碳酸钙的缝隙中缓缓地往下流动，最后分成了颜色不同的4层（如图所示）。

经过后来的研究，这4个层次中，青绿色的是叶绿素a，黄绿色的是叶绿素b，黄色的是黄嘌呤，橙色的是胡萝卜素。这就是液相色谱的起源。但实际上，色素的四种成分从玻璃管中分离需要几个小时的时间，并不是非常实用的方法。液相色谱正式在各个领域运用是从此后半个世纪后的1970年左右开始的。

高效液相色谱法（HPLC）基本上是柱式液相色谱法的一种高度改进形式。溶剂不是在重力作用下滴过色谱柱，而是在高达 400 个大气压 (psi) 的高压下强制流过，包括 HPLC 在内的所有色谱分离都遵循相同的基本原理：由于不同分子对流动相和分离所用固定相的相对亲和力不同，因此可将样品分离成不同的组分。

根据工艺中的相系统（固定），HPLC 有以下几种类型：

正相 HPLC ：这种方法根据极性分离分析物。NP-HPLC 使用极性固定相和非极性流动相。因此，固定相通常为硅胶。典型的流动相有正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。因此，极性样品会被保留在色谱柱的极性表面上，比极性较弱的物质保留时间更长。

反相 HPLC ：固定相为非极性（疏水性），流动相为极性液体，如水和甲醇或乙腈的混合物。其工作原理是疏水相互作用，因此材料的非极性越强，保留时间就越长。

体积排阻 HPLC ：色谱柱中填充有精确控制孔径的材料，颗粒根据其分子尺寸被分离。较大的分子会迅速通过色谱柱；较小的分子则会渗入填料颗粒的多孔内部，随后洗脱出来。

离子交换 HPLC：固定相表面带有与样品离子电荷相反的离子电荷。这种技术几乎只用于离子或可离子化的样品。样品上的电荷越强，其被离子表面吸引的程度也就越强，因此洗脱时间也就越长。流动相是一种水性缓冲液，pH 值和离子强度都用于控制洗脱时间。

HPLC 仪器包括输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据采集（处理）系统（如图所示），其中系统的核心是进行分离的色谱柱。

泵是HPLC系统中设置在最上方，把流动相从溶液瓶中输送到系统中的装置。HPLC开发初期达到高压力是泵的关键点，然而如今要保证高压力显然轻而易举，所以对泵的要求变成了在任何条件下都能保持压力和流动相流速的稳定。（流动相流速的变化会对测定的结果造成不良影响）

大多数的泵，由于是利用类似于活塞运动那样的往复运动，会对应往复运动的周期而产生压力变动（这里称为脉动）。为了减少这种脉动，花了很多功夫，如今的泵产生的脉动已经非常少了。然而，进行从前无法想象的微量样品高敏感度分析时，仅仅很小的流速变化都会对测定结果产生影响。所以，进行高灵敏度分析时需要更高精度的泵。

进样器是设置在泵之后，把需要分析的样品注入流动相的装置。最近，可以把多种样品以一定时间间隔连续注入系统的自动进样器也被广泛的使用。

如今的色谱柱和茨维特实验使用的填满碳酸钙的玻璃管的原理一样，但是柱子的材质由玻璃管换成了不锈钢管，中间的填料可以使用硅胶基质填料和聚合物基质填料。因为样品是在色谱柱中进行分离，所以说色谱柱是整个HPLC系统中最重要的组成部分。

广州研创的色谱柱产品图

HPLC使用的流动相，从酸性到碱性各种各样的溶剂都有。由于不锈钢对各种溶剂的耐受性都较好，所以HPLC用色谱柱大多使用不锈钢材质制成。然而，分析生化或者离子样品时，样品不能和金属接触，所以这种场合需要使用玻璃或者PEEK（聚醚醚酮树脂）材质的色谱柱。

样品的分离在色谱柱中进行，而分离后的结果需通过检测器才能转换成可以观察的形式。不含有样品的流动相的组成是一定的，流动相中包含了样品其组成就会发生改变，检测器可以将这种变化转化为电子信号。检测器根据不同的检测方法分为很多种类，常用的检测器有紫外吸收检测器、荧光检测器、质谱检测器和电化学检测器。

即使使用检测器把检测结果转化为了电子信号，也仍然不是能观察的形态。为了使其可被分析观察，以前是使用类似笔形记录器的装置，现在则使用基于电脑技术的数据处理器（也叫积分仪）。数据处理器从内藏打印机的文字处理器这种简易型式开始，已经发展成显示器、键盘、打印机各部分独立的类似电脑的形式，种类繁多。而且，如今还有出售专门的电脑用HPLC分析软件以及使用USB接口，即使是笔记本电脑也能简单提取数据的系统。

以上介绍的部分，都是HPLC系统最基础的部件。

高效液相色谱法（HPLC）已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。此外，高效液相色谱法可获得的信息包括化合物的分辨、鉴定和定量。它还有助于化学分离和纯化。高效液相色谱的其他应用包括：

制药应用：控制药物稳定性、药物剂型的片剂溶出度研究、药品质量控制等。

环境应用：检测饮用水中的酚类化合物、污染物的生物监测等。

法医学应用：生物样本中的药物定量、鉴定血液、尿液等中的类固醇、纺织品染料的法医分析、测定血液、尿液等中的可卡因和其他滥用药物等。

食品和香料：软饮料和水的质量测定、果汁中的糖分分析 蔬菜中多环化合物的分析、防腐剂分析等。

在临床检验中的应用：尿液分析、血液中的抗生素分析、肝脏疾病中胆红素和胆绿素的分析、检测脑细胞外液中的内源性神经肽等。