C18色谱柱会受到填料类型和柱规格的影响吗？

高效液相色谱（HPLC）具有高选择性、高灵敏度和快速分析的特点，大部分可溶解的药物都可通过该方法进行分析，因此已成为药物分析的首选技术。碳十八硅烷化学键合硅固定相（C18或ODS）的反相色谱在液相色谱分析中表现出色，相较于其他色谱具有明显优势。C18反相色谱能够直接分析水溶性样品，适用范围广泛，被誉为“标准固定相分离模式”。在各国药典中涉及使用液相色谱检测的品种中，C18色谱柱是最常被广泛应用的固定相。

由于键合方式、粒径、长度和内径等多个因素不同，C18色谱柱展现出不同的选择性。市场上出现了数百种具有不同分离特性的C18柱。如何在繁多的C18柱中找到适合自己分析的那种，是一个值得深入探讨的课题。

C18柱的选择主要考虑两个因素，分别是填料材料和规格对色谱柱的影响。

1、C18填料对色谱柱的影响

填充物的物理特性对填充物色谱行为有重要影响。主要的物理特性包括：粒径、孔径、孔容量、固定相化学性质、碳含量以及烷基化处理。

(1) 颗粒度是指填料颗粒的直径大小。色谱柱上注明的颗粒径实际上是一个平均值。例如，“5μm”的颗粒径并不代表柱内所有填料颗粒的直径都是5μm，实际上存在颗粒分布。这种分布对柱的反压和效果有重要影响。通常来说，颗粒越细，颗粒分布越小，色谱柱效果越好，反压也越高。目前C18柱的填料颗粒径为4至10μm。

(2) 孔径是指填料颗粒之间的空隙尺寸。通常所说的孔径是指填料的平均孔径大小。球形填料填充柱后，平均孔径分布较为集中，柱床结构均匀，分离效果好，稳定性高；而非球形填料的平均孔径分布较为广泛，柱床结构不均匀，流体相速度不均匀，色谱吸附带有扩散。平均孔径的大小对于分离大分子化合物有很大影响，在分离含有大分子化合物的样品时可能会出现分子排阻效应，或引起吸附效应，从而影响回收率和准确度。因此，在用反向相色谱分离如蛋白质或多肽样品时，应考虑使用大孔径(如30纳米)的反向相柱填料。孔体积作为硅胶多孔性的参数，在分离较大分子化合物时可作为参考，选择具有较大孔体积的反向相柱填料。

(3) 化学键合填料在高效液相色谱中扮演着非常关键的角色。它可以连接高极性的有机基团，并且使用低极性溶剂作为流动相。同样，它也可以连接低极性的有机基团，并且选用高极性溶剂作为流动相。C18 色谱柱采用了硅烷烷化键合方式（Si-O-Si-C），这种类型的键合反应目前被广泛应用。例如，使用十八烷基三氯硅烷与全孔硅胶M-Porasil-C18 反应生成烷基化学键合相，商标名为 M-Bondapak-C18。

碳含量指的是填料中的碳含量。传统的测量方法是通过将填料加热至碳氢键断裂，然后根据损失的重量或生成的二氧化碳来计算碳含量。增加碳含量可以通过增加碳键的长度或提高键合密度来实现。随着碳含量的增加，柱子的保留值也将增加。键合相的色谱表现与键合密度相关，同时也与硅胶密度和填料表面积相关。填料的密度越大，填充柱子所需硅胶的量就越多，柱子的碳含量也会较高。如果使用两种不同密度但碳含量相同的填料填充柱子，它们的保留行为将明显不同。因此，仅仅依靠碳含量来预测色谱表现是不足够的。

(5) C18硅烷化试剂是一种大于2纳米的大分子，因此与已经连接在相邻硅醇基上的C18硅烷化试剂会发生严重的立体位阻。这导致硅胶表面有大量残留的未反应硅醇基，这些极性硅醇基在一些色谱条件下会与碱性化合物发生相互作用，导致峰形拖尾，影响定量分析结果。通过烷基化处理可以在一定程度上解决这些问题。烷基化处理是一种在固定相上进行的独立反应，旨在减少硅胶表面的硅醇基。烷基化处理使用小分子试剂（如*硅烷），其空间位阻远低于C18基团。大多数固定相只有30%的键合位置可覆盖。据报道，通过有些高活性的化学试剂和特殊的反应条件，可使覆盖率提高至50%。深入了解硅胶固定相的物理特性将有助于在高效液相色谱中选择适合的色谱柱进行反应。尽管表面上C18柱的化学官能团可能相同，但实际上不同品牌的C18柱性能可能存在很大差异，导致不同的分离结果。

2、C18柱规格对色谱柱的影响

填料柱的选择对于色谱分离的可能性至关重要，而柱规格的选取直接影响了分析速度、分离能力、检测灵敏度以及每次分析所需的溶剂量等。柱规格主要包括两个方面：柱内径和柱长度。柱内径一般在分析型柱中为2～6 mm，制备型柱为20 mm，最大可达80 mm；而柱长度分析型柱一般在5～30 cm，制备型柱为15～50 cm。一般来说，柱内径不会影响分离效果和分析时间之间的关系。

如今，柱技术已发展到不同内径的柱子可以具备相同的性能。不同内径的柱具有各自特点，在相同的分析时间和分离效果下，内径较大的柱消耗的溶剂更多。另一方面，内径较小的柱需要的样品量也更少。因此，在样品有限的情况下，可选择内径较小的柱。增加柱长度虽然有助于改善分离效果，但也会增加阻力，需要增加入口压力。柱压同时影响着分离效果提升和分析速度减少，是一个重要的障碍。分离效果、分析速度和柱压之间相互制约，可以在两者之间做出选择，第三个因素也就随之确定。长柱具有更好的分离效果，短柱则可以实现更快的分离速度，我们可以根据样品情况来选择合适的色谱柱。