液相色谱柱的选择方法及使用过程中可能遇到的问题

选择液相色谱柱的方法和条件

1、填料基质

a.硅胶基质具有纯度高、成本低、强度大、易于进行化学修饰等特点，但其pH值适用范围有一定限制。一般硅胶基质填料在pH2-8之间能保持稳定，而经过特殊修改的硅胶键合相则可在pH1.5-10范围内保持稳定。

b.高分子基质：适用范围广泛的pH值，具有良好的温度稳定性（可高达80摄氏度以上），机械强度较低。

2、颗粒外形

绝大多数现代HPLC填料都采用球形颗粒，不过有时也会选择不规则颗粒。球形颗粒能够降低柱压，提高柱效和稳定性，并延长柱寿命，尤其在使用高粘度流动相时；而不规则颗粒则具有较大的比表面积，价格相对较低。

3、颗粒粒径

颗粒尺寸越小，柱效越高，分离度也更好，但会导致柱压力升高。为解决复杂样品问题，可选择粒径在1.5-3μm之间的填料，在UPLC中可以使用1.5μm的填料；而粒径为10μm或更大的填料则适用于半制备或制备柱。

4、含碳量

碳含量是指硅胶表面的键合相所占比例，与比表面积、键合覆盖度等因素有关。高碳含量可提高柱容量、分辨率和分析时间，适用于需要高度分离的复杂样品；低碳含量则可缩短分析时间、展现不同选择性，适用于快速分析简单样品或需要高水活性相条件的样品。通常C18的碳含量在7-19%之间。

5、孔径和表面积比

高效液相色谱（HPLC）的吸附介质是由多孔颗粒构成的，大部分反应都发生在这些孔的表面上。因此，分子必须进入孔道才能被吸附和分离。

孔径和比表面积是两个互相关联的概念。如果孔径较小，则比表面积会更大，反之亦然。若比表面积较大，会增加样品与组分之间的反应，提高保留、上样量和复杂组分的分离度；而比表面积较小的情况下，平衡时间更快，适合进行梯度分析。

6、孔容和机械强度

孔容，又被称作“孔隙容积”，是指单位颗粒所具有的空隙容积大小。它能有效地展现填料的机械强度。填料的孔隙容积越大，相对机械强度较弱的情况就会略微增加。孔隙容积小于1.5mL/g的填料主要用于HPLC分离，而孔容大于1.5mL/g的填料则适用于尺寸排阻色谱和低压色谱。

7、封端封端

封端可以减少极性碱性化合物的拖尾峰，因为它们与裸露的硅烷基相互作用。没有封端键合相与封端键合相会对选择性产生不同的影响，尤其对于极性样品更为明显。

液相色谱柱在使用过程中常出现的问题及解决方法

色谱柱使用过程中常见问题之一是柱压增高。柱压在长时间使用后逐渐上升属于正常现象。然而，若柱压在使用过程中突然升高（排除系统管路堵塞和压力传感器故障），可能存在以下几个原因：

1、柱头的过滤筛板被堵塞或污染；

2、填料受到样品污染。

3、在色谱柱内的缓冲液中，如果盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，就会发生结晶析出。

4、流动相的 pH 过大或过小会破坏或溶解固定相的结构。

以下是解决方案：

1、如果确定染色层析柱的过滤筛板被污染，可以尝试反向使用甲醇将其冲洗至正常压力，或者将柱头卸下放入10%稀硝酸中超声清洗10分钟，然后再用纯水超声10分钟，最后重新安装到染色层析柱中。

2、如果发现色谱柱填料受到污染，应拆下柱头螺丝，取出填料前段的污染部分，然后重新填入相同的填料，修复后再安装回柱头螺丝。

3、若确认结晶为盐类，请使用10%甲醇/水溶液冲洗色谱柱，使柱内所有盐类溶解，然后转换为高浓度甲醇。

4、如果 pH 值使用不当，恢复会变得非常困难。