干货丨HPLC中干扰峰的来源

与前两类干扰峰相比，液相系统干扰峰的解决更加困难。液相系统是一个动态过程，所以此类问题解决过程耗费时间长，而且要求实验人员有很高的色谱素养。我们对此类问题来源主要归结为三类：强保留物质、离子对污染和管路滋生细菌。

首先是强保留物质的干扰，其主要特征是宽峰。此类问题多数发生在等度洗脱中，梯度洗脱主要出现在高比例有机相处。这是由于强保留物质在当次进样中未洗脱出，在后续进样洗脱出来所致。如图7中9分钟处的色谱峰。

对于此类干扰峰，可通过延长采集时间或增加洗脱强度来消除对后续样品的干扰。至于如何延长采集时间，大家可通过下面的公式计算得到。

N＝5.54*(tR/Wb/2)^2（1）

由公式（1）推导可知

 tR＝Wb/2 *(N/5.54)^(1/2)（2）

其中，N-塔板数，在等度洗脱中N对所有峰相同；tR-保留时间；Wb/2-色谱峰半峰宽。

由公式（2）推知，tR2=tR1* W2b/2/W1b/2。积分结果显示，图7中，7min处的色谱峰W1b/2=0.12min，9min处的宽峰W1b/2=0.32min，由此可推知，图7中9min处的宽峰保留时间tR2=7*0.32/0.12=18.6min。图8为延长采集时间的图谱，20min处即为图7中9min处的色谱峰，与公式推导结果基本接近。延长采集时间后，后续图谱干扰峰消失。尽管按照此公式计算会有一定误差，但这足以让色谱工作者对其进行预判，设置合理的采集时间。

系统干扰峰第二个方面是离子对、螯合剂这种难以洗脱的试剂对液相系统的污染。此类污染物多半是由于使用完毕含有离子对、螯合剂之类的流动相后，对系统的冲洗不彻底所致。此类污染物主要对一些采集波长较低的方法产生干扰，普遍表现是基线噪音大或者干扰峰，但随着方法的运行会逐渐趋于正常。

系统干扰峰第三个方面是系统滋生细菌。对于系统滋生细菌，多数大家可能觉得不可思议，因为液相系统使用完毕都会用有机相冲洗保存。目前很多方法流动相A都是水相，虽然水相每日都会新配制，但如果由滤头到比例阀这一段管路长时间在水相中就会滋生细菌。随着时间的运行，梯度洗脱中会逐渐的产生干扰峰。此类问题虽然比较隐蔽，但比较容易解决，只要每日对放置纯水相的通道用有机相冲洗即可避免此类问题。

以上便是对干扰峰来源的简单分析。然而对于干扰峰的产生，要具体问题具体分析，因为其还与具体色谱条件有关。同一种试剂，在方法A中产生干扰，但在方法B中可能完全没有干扰。因为采集波长，有机相初始比例及最终比例等因素，都可能会对干扰峰的出现产生影响。

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实际工作中，色谱工作者遇到的最大困难是如何识别判断干扰峰属于哪一类。由于找不清问题根源，所以也就难以有针对性的解决问题。下面为大家简单分享一下解决干扰峰的小经验：

首先，判断干扰峰是来自系统还是供试品。此时需要运行两次采集：只运行梯度与正常进样。如果只运行梯度，未进样品，依然有干扰峰，这种情况下多半是系统所致，此时解决方向应针对液相体系，而不是针对供试品。鉴于有些型号的仪器，如果不进样，不会执行进样的动作。因此，对于此类仪器，建议执行正常进样与减少进样量两次采集，根据干扰峰的大小来判断是系统原因还是供试品原因。

其次，调查仪器使用记录，与实验人员交流。一般建议查看仪器使用记录，了解近期运行哪些方法以及这些方法的流动相组成。查看完相关记录后，再跟实验人员交流，了解其操作过程。比如，对于A通道滋生细菌问题，我们可以通过仪器使用记录发现，出现干扰峰的仪器近一周都是在运行同一个方法。实验记录显示，此方法的流动相为0.1%的磷酸水溶液，因此可能是系统滋生细菌所致。但实验人员告知，每天晚上都会用有机相冲洗色谱柱，不可能滋生细菌。再次询问得知，实验人员每晚的冲洗是切换成C通道执行，而A通道却一直在0.1%的磷酸水溶液中。因此，切换通道冲洗系统这种不规范操应尽量避免。

第三，采取单因素试验解决问题。每次只改变一个因素，逐步找到干扰峰的来源。此类做法看似比较费时费力，但却让色谱工作者对各类色谱问题产生原因有理性认知，增强了色谱工作者解决问题能力，有助于后期问题的解决排查。

最后，对单因素排查出的解决方案进行验证，将问题重现。如果根据单因素变量找到的解决方案无法将问题重现，很有可能排查出的影响因素并不是问题真正的根源，需继续排查。能够重现问题，问题才算解决，方可将其关闭，不再研究。