HPLC中，不同方式混合流动相是否会影响保留时间？

HPLC缓冲液通常用于控制在液相色谱分析中所不希望出现的二次相互作用。此外，缓冲液也被用来工作分析物的电离状态，以确保分析物不会同时出现一个以上的电离状态。

化合物的pKa值代表此化合物的50%离子化和50%中性时的pH值。如果在此pH值下分析此化合物，你会看到分裂峰的出现或者不稳定的保留时间。因此，我们建议所有的分析方法的pH值都应该控制在目标分析化合物的pKa值正负两个pH单位以上。

1.尽可能提前预混合你所使用的流动相，因为这将防止经过泵混合流动相时会出现的错误。

2.每一次都需要始终使用相同的配制方法及流程。例如，如果你方法是先加水，那你每次都必须是先加水。如果你是先测定单独的成分然后再混合，那你就必须每次都按这个流程来做。记得千万不要改变这一个固定的配制流程，因为这个配制流程的改变让分析物的保留时间可能出现很大的改变。

以下的这个实验例子展示了当流动相

用以下不同的方式来混合时，

峰保留时间可能出现的改变

先加水：先用量筒量400mL的水并倒进1L的容量瓶中，然后用甲醇稀释至容量瓶的刻度。

先加甲醇：先用量筒量600mL的甲醇并倒进1L的容量瓶中，然后用水稀释至容量瓶的刻度。

甲醇和水各自先量好：先用量筒量600mL的甲醇并倒进流动相瓶中，然后用同样的量筒量400mL的水并倒进已经装有甲醇的流动相瓶中。

让液相的泵来混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇。

缓冲液的浓度必须非常精确地平衡好，以确保在所有的条件下都能达到完全溶解。在反相条件下，如果方法条件是包含了高比例有机相的话（例如跨度很大的梯度），则很有可能需要控制缓冲液的浓度，以确保不会出现缓冲盐的析出。

当开发一个可靠稳定的HPLC方法时，流动相的贡献跟色谱柱固定相的选择性一样重要，另外流动相的选择与配制也是一样重要的。