反相色谱柱污染物清洗时有哪些清洗方法？

反相色谱是目前在高效液相色谱中被广泛应用的技术，主要原因是它适用于大多数非极性物质以及许多可离子化和离子化合物的分析。

如果某色谱柱出现污染问题，通常是因为在进行重复进样时，强保留物质逐渐累积导致的。简单的清洗步骤通常足以清除这些污染物，以恢复其色谱性能。在进行等度运行后，如果使用90～100%含量的溶剂B（比如甲醇、乙醚和四氢呋喃等双溶剂反相系统中洗脱能力较强的溶剂）冲洗20个柱体积，即可清除污染物。需要注意的是，色谱柱的柱体积和空柱管体积是不同的概念，例如一根4.6x250mm的柱子的柱体积只有2.5ml，而2.1x150mm的柱子则只有0.28ml的柱体积。

若采用缓冲盐系统，请勿直接切换至强溶剂，因为突然切换至高浓度有机溶剂可能会导致缓冲盐在HPLC流动体系中沉淀，进而引起更严重的问题，如柱头筛板堵塞、连接管路堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。建议先使用无缓冲盐流动相(即用水代替缓冲液)，冲洗5 ~ 10个柱体积，然后再切换至强溶剂清洗。

某些情况下，即便使用强溶剂B，也难以清除附着在色谱柱上的污染物。此时就需要运用更为强力的溶剂，或采用一系列溶剂的组合。

如果污染物不是生物质的，一种强效溶剂或者几种溶剂组合的清洗方法基本可以解决问题。许多柱子生产厂家的官网和产品说明书上也会提供清洗方法的推荐。

所有清洗方法的步骤通常相似，使用的溶剂强度会逐渐增加，最后一个溶剂通常会是非极性非常强的，例如醋酸乙酯或者烷烃，以便溶解非极性污染物如脂质和油类。每个溶剂在系列中都要确保与下一个溶剂互相溶解。

在完成整个清洗过程后，必须采用一种中等强度、互溶性非常好的溶剂来过渡回到原来的流动相体系。例如，我们可以选用异丙醇作为过渡溶剂，因为它既能与正己烷或二氯甲烷互溶，也能与水相溶剂互溶。然而，由于异丙醇的粘度很高，我们需要保持较低的流速，以避免造成泵压过高的情况。