生物分离介质分离纯化中可去除内毒素

　　内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。

　　其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的较外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素可以用鲎试剂检测。

　　内毒素的去除

　　被污染的产品去除内毒素即使在生产中采取了有效的工艺和严格的预防措施,原液仍有可能被污染,如何处理已被污染的原液是比较棘手的问题。因为原液中通常已加入保护剂,重新纯化是非常困难的。如果原液及保护剂的分子量与内毒素分子量差别较大,那么选用适当的的超滤膜,通过超滤来去除内毒素是可能的,但由于膜吸附过程中产热及系统残留等原因,活性损失较大。

　　生物制品在生产过程中去除内毒素也是纯化环节中重要一环节。生物制品的纯化,主要是采用各种柱层析技术,如疏水层析、离子交换、亲和层析、分子筛等,这些技术纯化目标产品的同时也可以有效去除内毒素。

　　三、各类层析介质去除内毒素原理和情况

　　1.分子筛：分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。一般重组产品分子量为几万道尔顿,而内毒素分子量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛可以有效去除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。

　　2.疏水层析：内毒素的脂肪A部份有很强的疏水性,但在高盐下会凝集,无法挂上疏水层析柱。可选择能结合目标蛋白的疏水介质而去除内毒素。

　　3.离子交换：离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。内毒素在pH>2时带负电荷,与阴离子交换介质Q Bio-sep FF或DEAE Bio-sep FF有较强结合,可在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或NaOH去除,这是离子交换法去除内毒素的基础。Pharmacia公司已开发利用离子交换层析法从白蛋白中去除内毒素的工艺,主要采用DEAE Sepharose Fast Flow介质,将被内毒素污染的白蛋白上柱,白蛋白和大部分内毒素结合于介质上,先清洗掉不结合的内毒素,然后选择性洗脱白蛋白。

　　4.亲合层析：亲合层析技术,特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用,以目标蛋白作为抗原,将通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体偶联于介质上,以此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性,理论上仅有目标蛋白吸附于介质上,内毒素全部穿透,洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。实际上,由于介质本身存在的非特异性吸附,仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附,但内毒素含量是极低的。在干扰素(IFN)生产中,洗脱物内毒素含量一般为0.25EUmL-1。

　　目前较为有效的处理方法是采用亲和层析技术将毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶联于CNBr activated Bio-sep FF或NHS-activated Bio-sep FF上,以此介质特异性吸附内毒素,而让蛋白通过。