聊聊液相色谱仪的常见错误操作

在药物研发分析中，液相色谱仪的一些常见错误操作可能会导致这台昂贵的设备在使用几次后就出现故障。那么，在液相色谱分析实验室中有哪些操作是应该避免的呢？

1、流动相不进行过滤。

由于尘埃或其他杂质颗粒会磨损柱塞、密封圈、缸体和单向阀，因此应该在使用前清除流动相中的固体颗粒。流动相最好在玻璃容器中进行蒸馏，常用的方法是通过过滤，可以使用滤膜（0.2μm或0.45μm）等过滤器。泵的进料口应连接砂滤棒（或片）。输液泵的过滤器需要定期清洁或更换。

2、使用后未能及时清洁泵。

流动相中不应含有任何腐蚀性物质，而含有缓冲液的流动相在泵内不应长时间存留，特别是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果剩余的含缓冲液的流动相长时间留在泵内，可能会因蒸发或泄漏，甚至因溶液静置而析出盐微细晶体。这些晶体同样会损坏密封环和柱塞等部件。

因此，在彻底清洗泵之后，必须注入纯水，然后更换为适合色谱柱保存并有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以使用甲醇或甲醇-水溶液）。

3、流动相走空

在泵工作时，必须注意防止溶剂瓶中的流动相耗尽，否则即使是空泵运转也会对柱塞、缸体或密封环造成磨损，最终导致泄漏。

如果没有流动相排出，并且没有压力指示，应该怎么处理呢？

泵内可能积累了大量气体，这时可以打开泄压阀，让泵以较大流量（例如5ml/min）运行，以排出气泡。同时也可以在泵出口处使用一个50ml的针筒来辅助排出气体。另一个可能的原因是密封环磨损，这时需要进行更换。

4、压力和流量不稳定了？

可能出现问题的原因包括气泡的存在，需要进行排查；或者是单向阀内有异物，这时可以卸下单向阀，并用丙酮进行超声清洗。有时，砂滤棒内也可能存有气泡，或者被细小的盐晶粒或滋生的微生物部分堵塞。对此，可以卸下砂滤棒，浸入流动相中进行超声去气泡，或者迅速将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）以去除微生物，随后再将盐溶解并立即进行清洗。

5、压力为什么会过高或过低？

管道可能出现了堵塞，需要进行清理和清洗。而压力降低的原因可能是管道存在泄漏。在检查堵塞或泄漏时，应逐段进行仔细检查。在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合且组成不断变化，可能会出现一些特殊问题，这些问题需要高度重视。

在液相色谱分析中，对于组分复杂的样品，通常采用梯度洗脱的方法。这种方法是在同一个分析周期内，根据一定的程序不断调整流动相的浓度比例，称为梯度洗脱。通过这种方式，可以使得复杂样品中性质差异较大的组分，根据各自的容量因子k，达到良好的分离效果。梯度洗脱的优点包括：1. 缩短分析时间；2. 提高分离效率；3. 改善峰型，减少拖尾现象；4. 增强灵敏度。然而，有时可能会导致基线漂移的问题。

6、梯度洗脱时流动相选择不当

需要注意溶剂之间的互溶性，不能将不相互混溶的溶剂用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在特定比例下是可以混溶的，但一旦超过这个范围，它们就会变得不再互溶，因此在使用时要格外留意。

当有机溶剂与缓冲液混合时，可能会出现盐晶体的析出，特别是在使用磷酸盐时需要特别注意。

7、被忽视的空白梯度洗脱

梯度洗脱所用溶剂的纯度要求较高，以确保良好的重复性。在分析样品之前，必须进行空白梯度洗脱，以识别溶剂中的杂质峰，因为在弱溶剂中，杂质会积聚在色谱柱的顶部，并在用强溶剂时被洗脱下来。此外，用于梯度洗脱的溶剂需要进行脱气，以避免混合过程中产生气泡。

8、忽视了溶剂混合导致的粘度变化。

混合溶剂的粘度通常会随着组成的不同而发生变化，因此在梯度洗脱时，压力往往会出现波动。例如，甲醇和水的粘度都相对较低，但当它们以相似的比例混合时，粘度会显著增加，此时的柱压大约是使用纯甲醇或水作为流动相时的两倍。因此，在进行梯度洗脱时，需要特别注意避免压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大值。

为了减轻这种压力波动带来的潜在风险，实验者可以采取一些预防措施。首先，可以尝试调整梯度程序，使得粘度变化较大的溶剂配比变化更为平缓，避免急剧的浓度跃迁，这样可以有效减少柱压的瞬间激增。其次，选择粘度相对稳定的溶剂组合进行梯度洗脱，或者通过加入适量的添加剂来调节混合溶剂的粘度，使其在整个梯度范围内保持相对稳定。

此外，梯度洗脱过程中还需注意温度对溶剂粘度和分离效果的影响。保持色谱柱和流动相恒温，有助于减少由于温度变化引起的溶剂粘度波动，从而提高分析的稳定性和重复性。实验者可以利用色谱仪的温度控制系统，设定合适的柱温和流动相温度，确保分析条件的一致性。

最后，定期维护和检查液相色谱系统同样至关重要。检查管道、单向阀、砂滤棒等部件是否堵塞或磨损，及时更换老化的密封环和柱塞，保持输液泵和色谱柱的良好状态，可以有效减少因设备故障导致的分析误差。同时，记录和分析每次梯度洗脱的实验数据，不断优化梯度程序和操作细节，也是提升液相色谱分析效率和准确性的关键步骤。通过这些综合措施，可以最大限度地发挥液相色谱仪在药物研发分析中的价值。