手性色谱柱怎么用，七步搞懂！

栏目：行业资讯 发布时间：2024-07-18
手性色谱柱是液相色谱分析制备中经典的耗材，如何正确使用手性色谱柱、延长手性色谱柱的使用寿命？拿到新的色谱柱我们应该干什么？还不知道的就跟小研一起来看看吧。
手性色谱柱是液相色谱分析制备中经典的耗材，如何正确使用手性色谱柱、延长手性色谱柱的使用寿命？拿到新的色谱柱我们应该干什么？还不知道的就跟小研一起来看看吧。

01
色谱柱构造

在使用手性色谱柱之前，让我们先来了解一下手性色谱柱的基本结构。色谱柱是由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。
（图源于网络，侵删）


色谱柱柱管通常由不锈钢、玻璃或聚合物材料制成，以确保足够的机械强度和耐腐蚀性。


柱管的内径和长度根据应用需求有所不同，分析柱基本的内径范围为2.1mm到4.6mm，长度从50mm到250mm不等，最常用的规格是4.6*250mm。

压帽用于固定填料，防止填料在使用过程中泄漏。

筛板则用于支撑填料，确保流动相能均匀流过。

02
固定相

固定相又称为色谱填料，是色谱柱的核心，是色谱分析的关键部分。在色谱分析中，流动相携带样品通过色谱柱，样品中的各组分在固定相与流动相之间发生分配、吸附、解吸等过程，从而实现组分的分离。分离后的组分随流动相流出色谱柱，经检测器和数据处理系统后得到色谱图。

手性固定相的类型有以下几种：

  1. 多糖类：主要有纤维素型与直链淀粉型
    2. 纤维素由 β-D-葡萄糖单元通过 1,4-糖苷键连接而成的线状聚合物。结构高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子。

    直链淀粉由 α-D-葡萄糖单元通过 1,4-糖苷键连接而成，存在一个左手四重螺旋结构，结构更为有序。直链淀粉的螺旋比纤维素要更大、更规律且更为刚性。

  2. 环糊精类
    3. 环糊精（Cyclodextrin，简称CD）是由直链淀粉经酶发酵生成的一类寡糖化合物，常用的有α，β和γ-环糊精，分别包含6、7 和8个葡萄糖单元，其中β-环糊精应用范围最广。因为β-环糊精溶解度最好、刚性最强，疏水性空洞内可嵌入各种对映体分子，形成包络复合物，对手性分离有良好的选择性，因此其衍生后特别适合芳香型化合物的手性分离。

  3. 蛋白质类
    4. 如BSA牛血清蛋白，氨基酸残基可提供手性位点，手性药物对映异构体与手性位点可以产生不同作用力，如氢键、疏水作用、静电作用等，从而实现对映体拆分。
    BSA作为甲氨蝶呤的专用柱，已写进中国药典。

  4. 其他手性固定相
    如大环类（抗生素及冠醚）、配体交换型、分子印迹聚合物等……



03
流动相
流动相体系的选用是与固定相之间形成一个竞争机制，使得在流动相的洗脱下对映异构体得到分离。

选定色谱柱后，可选用的溶剂种类就有了一个范围，在色谱柱溶剂使用的范围内进行流动相体系的依次筛选。

首先使用常规流动相，如在正相体系下，优先选择正己烷、异丙醇、乙醇等的流动相，而反相体系下，优先选择乙腈、水、甲醇作为流动相。如拆不开再选用非常规的流动体系，如二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等。

但需要注意的是：涂覆型手性固定相禁用强溶剂作为流动相，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯以及丙酮等，否则会使多糖衍生物溶解或溶胀，破坏固定相，只能用非极性烷烃和醇作为流动相。

此外，流动相体系还可以添加缓冲盐，调节流动相的pH值和离子强度，从而影响手性化合物与手性固定相之间的相互作用，提高分离度和改善峰形。常用缓冲盐主要有：磷酸盐、铵盐、硼酸盐等。

04
新柱使用前的注意事项


1.新柱安装：在使用新色谱柱之前，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物 。

对于正相手性色谱柱，出厂保存条件为正己烷/异丙醇=90/10。使用时，请先用正己烷/异丙醇=90/10 冲洗色谱柱30 min，再更换为目标流动相稳定系统至基线平稳。


而反相手性色谱柱的色谱柱出厂保存条件为乙腈/水=90/10。使用时，请先用乙腈/水=90/10冲洗色谱柱30min，再更换为目标流动相稳定系统至基线平稳。


2.使用合适试剂：接入手性色谱柱前，须先用合适的溶剂冲洗流路（包括流通阀、定量环和自动进样器）。

注意：部分溶剂（如丙酮、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃等）强溶剂会破坏涂覆型手性固定相的结构，因此不得使用它们作为流动相或溶剂溶解样品。


3.逐步提高流速：当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上，然后逐步提高流速至常规分析时所使用的流速。

05
色谱柱保养


1.定期测试：定期进行柱效测试，记录理论塔板数、分离度与压力，从而追踪监控色谱柱的性能变化。
2.保存条件：

正相手性色谱柱在使用含酸/碱添加剂的正相流动相后，需用正己烷/异丙醇=90/10冲洗色谱柱30min，然后用正己烷/异丙醇=90/10封存。

反相手性色谱柱在使用含酸/碱添加剂的反相流动相后，需用乙腈/水=90/10 冲洗色谱柱30min，然后用乙腈/水=90/10封存；使用含缓冲盐流动相后，需要用不含缓冲盐同比例流动相冲洗色谱柱30min，然后用乙腈/水=90/10封存。

3.避免极端条件：色谱柱应避免长时间处于极端pH或高温条件下，这可能会导致色谱柱性能下降或老化 。

4.进样前注意事项：


进样前需过滤样品溶液。


必须使用色谱级试剂配制流动相，使用前需经0.45μm滤膜过滤和超声脱气处理。


反相流动相一般使用甲醇、乙腈、水，流动相允许的最高有机相比例为100%；最高的水相比例为60%。

06
pH适用范围

以广州研创手性色谱柱为例，pH适用范围为2～8，手性固定相对手性化合物分离的选择性主要依赖于立体选择性相互作用，如氢键、π-π相互作用等，这些相互作用对pH值较为敏感，通常推荐在中性或接近中性的pH条件下使用，以避免对固定相的损伤或影响手性分离效果。



07
使用保护柱

保护柱对于确保手性色谱柱的长期稳定运行和延长其使用寿命非常重要。保护柱能够预先捕获可能堵塞分析柱的颗粒物和其他杂质，从而避免对分析柱造成损害。

此外，选择保护柱时，应确保保护柱的填料与分析柱的填料一致，以保证选择性的一致性。保护柱的规格，包括填料粒径和内径，也应与分析柱相匹配。


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