高效液相色谱仪(HPLC)由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。检测器是HPLC的关键组成部分之一,它将色谱柱连续流出的样品组分转变成易于测量的电信号,被数据系统接收,得到样品分离的色谱图。常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。接下来让我们详细介绍一下在液相色谱中六种检测器的原理及特点。
紫外检测器是一种应用最广HPLC检测器,当检测波长范围包括可见光时,又称为紫外-可见检测器。紫外检测器的工作原理是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。其特点是灵敏度高(检测下限为10-10g/ml),线性范围宽,噪声低,它的最重要特征是对流动相的流速和温度变化不敏感,适用于梯度洗脱,对强吸收物质检测限可达1ng,检测后不破坏样品,可用于制备,并能与任何检测器串联使用。紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似,实际上就是装有流动相的紫外可见光度计。 因此即使是那些光吸收小、消光系数低的物质也可用UV检测器进行微量分析。但它只能检测有紫外吸收的物质,而且流动相有一定限制,即流动相的截止波长应小于检测波长。如果溶剂中含有吸光杂质,则会提高背景噪音,降低灵敏度。此外,梯度洗脱时或测定波长较短时,基线还会产生漂移。光电二极管阵列检测器(PAD)原理与UVD相同,区别在于PAD可检测到所有波长的吸收值,是全扫描光谱图。PAD的优点是可以获得样品组分的全部光谱信息。
即,在一次色谱操作中,可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外-可见光谱图在一起的三维谱图,提供既定量又定性的色谱信号。吸收光谱用于组分的定性,色谱峰面积用于定量。使用二极管阵列检测器,可以对色谱峰进行光谱扫描,峰纯度鉴定的定性分析,在方法研究中可以快速选择最佳检测波长,在多组分混合物分析中可以编辑波长程序。采用二极管阵列检测器进行论证,也是目前常采用的一个强有力的手段。它通过对一个色谱峰的数点进行紫外扫描,然后比较所得到的扫面图谱的接近程度从而评价被检测峰的纯度。但是,利用二极管阵列检测器进行峰纯度检查存在两个缺点:1、杂质浓度低,或与主成分相比吸收太小,达不到检测灵敏度,无法检测出来。2、当杂质的发色团与主成分一致,或者说杂质与主组分有相同或几乎相同的光谱图且具相近的流出时间,此时杂质也无法发现。荧光检测器是一种高灵敏的选择性检测器,其灵敏度比紫外检测器高10-1000倍。它适用于检测能产生荧光的化合物。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物,再进行荧光检测。它的原理为有机共轭芳环分子受紫外光激发后发出荧光。
荧光检测器其灵敏度很高,痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用。其最小检测浓度可达0.1ng/ml,适用于痕量分析;一般情况下荧光检测器的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级,但其线性范围不如紫外检测器宽。
可用于荧光检测的物质有某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、生物碱和甾族化合物等。由于荧光检测器的高灵敏度和选择性,它是体内药物分析常用的检测器之一。 但其基线稳定需要平衡的时间较长。
示差折光检测器的检测基于被分析物的折光指数的差异,即测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别。当折光指数差异最大时灵敏度也达到最大。它并不测量绝对的折光指数而是测定折光指数的差别。其典型的应用领域为没有紫外吸收、荧光的化合物,例如:碳水化合物、聚合物脂肪酸及油脂类等。光从一种介质进入另一种介质时,由于两种物质的折射率不同就会产生折射。只要样品组分与流动相的折光指数不同,就可被检测,二者相差愈大,灵敏度愈高,在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。示差检测器为通用检测器,容易使用。通常来说是比较耐用的检测器,维护成本低。但其灵敏度低、选择性差,对流速、温度及粘度的变化敏感,不能用于梯度洗脱。而且,色谱峰可能是正的,也可能是负的。电化学检测器包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。电导检测器广泛用于离子色谱仪中,应用于能电离成离子物质的检测,其响应受温度影响较大。
安培检测器应用最广泛,其灵敏度很高,尤其适合于痕量组分的分析,凡具氧化还原活性的物质都能进行检测,如活体透析液中的生物胺,还有酚、羰基化合物、巯基化合物等。本身没有氧化还原活性的化合物经过衍生化后,也能进行检测。
电化学检测器是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测。在液相色谱中,它可以检测出所有电活性物质。因此,对部分没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的物质,可采用电化学检测法进行检测。若在分离柱后采用衍生技 术,还可将它扩展到非电活性物质的检测。
化学发光检测器(Chemiluminescence detector, CD)是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器,因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应,生成处于激发态势反应中间体或反应产物,当它们从激发态返回基态时,就发射出光子。
由于物质激发态的能量是来自化学反应,故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后,立即与适当的化学发光试剂混合,引起化学反应,导致发光物质产生辐射,其光强度与该物质的浓度成正比。
这种检测器不需要光源,也不需要复杂的光学系统,只要有恒流泵,将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中,使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光,通过光电倍增管将光信号变成电信号,就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10-12g。
在化学史上有许许多多精美绝伦的实验,美国的“化学与工程新知”组织在2003年,邀请全球的众多化学家和历史学家共同投票选出十大最美丽实验,排名第一的是19世纪中叶巴斯德在显微镜下手工分离手性酒石酸盐晶体。蒸发光检测器(ELSD)是基于光线通过微小的粒子会产生光散射现象的原理。样品经色谱柱分离后会被氮气喷为雾状液滴,云雾状溶质颗粒通过光路后产生光散射。ELSD要优越于RID,灵敏度及检出限高,对温度敏感程度低,适用于梯度淋洗。检测器是高效液相色谱仪的重要组成部分,不同的检测器的原理、使用的范围和对象不同。所以针对不同的检测器,我们应该注意的重点也不同。只有这样,才能更好地完成日常的分析检测工作,提高工作效率。