在液相色谱中，缓冲液如何选择？

栏目：行业资讯 发布时间：2023-10-26
缓冲液指由一种共轭的质子给体和质子受体构成的可离子化合物的溶液，在液相色谱使用时，加入少量酸或碱时维持溶液pH稳定的作用。

缓冲液（Buffer）


缓冲液指由一种共轭的质子给体和质子受体构成的可离子化合物的溶液，在液相色谱使用时，加入少量酸或碱时维持溶液pH稳定的作用。

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缓冲液作用

1.缓冲分析物，使其保持在所需的pH值处。由于在实际分析工作中，色谱柱上的样品质量非常少，因此仅需要很少的缓冲液就能为样品提供足够的缓冲。如果样品与流动相的pH值相差大，且进样量太大，建议在进样前先调节样品溶液至接近流动相pH值。
2.缓冲色谱柱，使其保持恒定的pH值。由于大量的缓冲流动相通过色谱柱，所以固定相不断暴露在缓冲液中。随着现在商品化的硅胶基质色谱柱纯度的提高，硅胶上的酸性硅醇基团的含量也越来越低，因此所需的缓冲液也越来越少。



缓冲液的浓度

缓冲盐的浓度缓冲盐的浓度对离子样品保留值的影响通常较小，浓度一般为10-50mmol/L（但是最好根据具体情况确定）。



缓冲液的类型

主要取决于所需要的缓冲能力，在反向色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型的样品的保留随pH改变而明显变化。通常在pH2-4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高。因此建议将这范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。缓冲盐溶液的pH值越接近其pka，缓冲能力越强。一般缓冲盐溶液的pH值应在其pka±1的范围内。




缓冲液的离子缔合

如酸性条件下分离碱性化合物，加入NH₄CL，碱性物质离子与反离子相互作用的平衡导致它们相互的溶剂化并形成相关复合物离子：[碱]+[Cl]⁻  = [碱+Cl⁻ ]；在低pH时，碱性化合物被完成质子化，溶液阴离子（如CL⁻ ）在流动相中破坏了碱性物周围的水分子并增加其疏水性，导致样品保留时间增加，当盐浓度大于50mM时，保留时间略有下降，这可能是饱和反离子CI-引起的离子相互作用的屏蔽作用。此外还可以添加硫酸钠或者高氯酸钠等改变碱性化合物的保留。



缓冲液的注意事项

1.缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液。
2.由于缓冲盐可能与设备、样品和或色谱柱发生作用因此要特别注意，例如磷酸盐，在含有高浓度有机相（70%以上），可能会析出；一些缓冲剂放置即降解，贮存或长期使用后其紫外吸收会增加（如：TFA、三乙胺）；一些缓冲盐能通过形成离子对，对样品发生作用（如三氟醋酸缓冲剂与阳离子样品，三乙胺与阴离子样品等）。


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