反相色谱柱的活化步骤和优化条件

反相色谱柱具有硅胶和聚苯乙烯色谱柱的优点，摒弃了这两种色谱柱的缺点。以乙烯醇共聚物为基质的色谱柱，即使碳含量高，也能保持表面湿润。多孔结构对小分子化合物有足够的平均孔径.肽和小分子蛋白可以产生理想的分离效果。在有机溶剂比例较高的流动相中，色谱柱具有与硅胶基质色谱柱相同的柱效应，但在碱性缓冲溶液为流动相的情况下，其分离效率超过硅胶色谱柱。其中一个显著的特点是烷基填料的洗涤顺序，其保留能力与碳链的长度成正比。

反相色谱柱的活化步骤:

1.用20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱；

2.如果流动相含有缓冲盐，用与流动相中盐相等比例的超纯水和有机相冲洗过渡。用量为20倍柱体积，然后用含缓冲盐的流动相平衡色谱柱，用量为20倍柱体积或以上；

3.流动相不含缓冲盐的，用流动相平衡色谱柱，用量为20倍以上；

4.压力基线稳定，如不稳定，可延长平衡时间。

优化反相色谱柱的条件：

确定色谱柱规格.适当的固定相柱填料.流动相溶剂和改性剂后，可以开始优化方法。方法的优化是根据目标来决定的。如果你想开发一种质量控制方法，可能需要更少的可变因素，比如等度分离。如果目标是获得更高的分离度，节省分析时间并不是主要问题，你可以选择一个长柱来获得更大的分离度。如果分离速度非常重要，则应使用短柱和高流速。对于含有许多保留不同目标化合物的复杂样品，等度分离可能无法解决问题，应开发和优化梯度方法。

水相溶剂和反相色谱中的弱溶剂被称为流动相“A”，“B”溶剂是一种具有高相和强相的溶剂。在反相色谱模式下，当B的百分比增加时，保留率通常会降低。请注意，在开发样品的实际分析方法之前，大多数人都开发了HPLC采用所有方法“反复实验”方法，即尝试各种流动相条件，以找出更好的条件。