高效液相色谱柱的规范使用及正确清洗

高效液相色谱柱的标准使用包括：安装保护柱、过滤流动相和样品、净化样品、防止柱压过高、注意温度和pH值、正确及时清洗等。

一.加装保护柱

保护柱的作用是过滤流动相和样品化学“拉圾”同时，还能有效去除流动相和样品中的不溶性物质。现在的色谱仪在流动相吸入口.进样阀后部及色谱柱两侧均配有1个.2μm不同孔径的滤器只能去除不溶性颗粒，不能去除化学污染。因此，有必要安装保护柱，特别是在分析中药时.中成药等复杂混合物和生物样品是保护分析柱不可缺少的措施。

保护柱填料应与分析柱一致，粒度可大于分析柱。保护柱是一种耗材。经过一定次数的样品分析（50~100次）后，当柱压明显上升或峰值变质或基线漂移时，应更换保护柱。

二.过滤流动相和样品

流动相一般由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成。原则上，所有流动相都应通过色谱柱过滤，但在实际操作中应根据具体情况有所不同：当有机溶剂采用色谱纯度、石英亚开水或其他超纯水时，过滤在保证水和有机溶剂的质量而不受污染时没有更多的实际意义。

当流动相中含有缓冲盐时，需要过滤。如前所述，缓冲溶液放置一段时间后根据环境温度不同，夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周)，使用前应再次过滤。

注入流路系统前，样品试液应经0.45μm(0.22μm最好过滤孔径滤膜。注意区分水系和油系，两者不能混用，以免滤膜溶解造成污染。

装有流动相的器皿和色谱系统中的在线滤器应定期清洗和更换，以防止滤器因过载而无法过滤。

三.净化样品

样品中含有对色谱柱有害的化学成分，如永久吸附的蛋白质.糖和其他有机分子和强吸附物质，以及可能破坏柱填料的基团离子。样品应尽可能分离和纯化，以去除多余的杂质。

四.防止高效液相色谱柱柱压过高

尽管高效液相色谱柱能承受6万的压力psi(磅/平方英寸)，但过高和过大的压力变化会缩短色谱柱的使用寿命，预防的方法是防止色谱柱的使用寿命。

(1)柱压过大时，尽量选择较小的流速，以免超过柱最大允许压力的一半。

(2)当流速较大时，应采用流速梯度的方法使流速分步到位。

(3)使用手动进样阀时，进样阀的转换应尽可能快。否则，超过20%的压力冲击很快就会使柱子报废。使用多柱时，应避免在高压下进行柱转换。

五.注意温度和pH值

硅胶色谱柱的最高使用温度一般不超过60℃,以低于40℃适宜，尤其是流动相pH接近使用限度时，应降低使用温度。

如果温度过高，会加速键合相的水解和硅胶的溶解，从而改变填料特性、柱床塌陷、柱效和峰形。

目前键合硅胶色谱柱标注pH适用范围可达2~10，但在实际使用中应避免极端pH条件，特别是碱性条件，特别是碱性条件(pH≥8)下使用，如必须在极端使用pH在环境使用中，可采用以下方法防止柱损伤：

(1)在泵与进样阀之间安装预柱(饱和柱)来饱和流动相；

(2)降低使用温度；

(3)检测完成后，立即与所用流动混溶。“柔和溶剂”完全清洗。

六.高效液相色谱柱正确及时的清洗

在开始实验之前，你应该知道柱子里目前是什么样的溶剂。对于新的色谱柱，如果没有特殊的表示，则是评估报告中使用的流动相。柱中当前的溶剂必须与分析样品中使用的流动相互溶解。如果不能混合，则应使用第三种溶剂与两者混合。

异丙醇是唯一能与各种溶剂混合的试剂，可作为中介流动相使用。相反，硅胶柱的适当储存环境是纯甲醇。如果分析流动相作为缓冲液2有机溶剂，可以用甲醇含量较低(20%)的甲醇2水代替原来的纯甲醇，然后分析流动相，避免柱内盐的沉淀；

实验结束后，应及时使用适当的溶剂清洗系统，最终转化为纯甲醇清洗。对于含有缓冲盐的流动相，最好的方法是用流动相完全一致但不含缓冲盐的溶液进行清洗，然后逐渐转化为纯甲醇清洗。

大多数人报道，冲洗液的体积约为柱容量的15~20倍，但最终应该是基线是否平直.压力是否稳定决定。

一些制造商的色谱柱表明，流动相中有机相的最低浓度为≥5%，使用时要注意。