C18柱的填料对色谱柱的影响

C18柱的填料对色谱柱的影响：柱填料的物理性能对填料的色谱化行为有重要影响。填料的主要物理性能包括：颗粒度、孔径、孔体积、键相化学、含碳量和烷基化处理。

（1）颗粒度是指柱状填料的颗粒直径。事实上，色谱柱上的颗粒直径是一个平均值。例如，颗粒直径5μm并非所有的颗粒直径为5μm，但实际上它们具有颗粒分布度。这种分布度对柱的反压力和柱效应有重要作用。一般来说，颗粒越小，颗粒分布越小，色谱柱效应越高，反压力越高。目前，C18柱填料的粒径在4~10μm之间。

（2）孔径是指填充物颗粒之间的孔隙。一般孔径是指填充材料的平均孔径。球形填料柱体的平均孔径较窄，柱体床结构均匀，柱体效应高，再现性好；无定型填料的平均孔径分布较宽，柱体床结构不均匀，流动相线速度不均匀，光谱带宽。平均孔径的大小对分离大分子化合物有很大的影响。当分离含有大分子的样品时，可能会产生分子排放效应，或产生吸附效应，影响定量的回收率和准确性。因此，在使用反相光谱分离等蛋白质或多肽样品时，应考虑选择大孔径（如30nm）的反相柱填料。孔体积作为硅胶多孔的参数，可作为大分子化合物分离分析的参考，选择大孔体积的反相柱填料。

（3）在高效液相色谱法中，化学键合填充材料占有非常重要的地位。它可以使用极性较小的溶剂作为具有较大键合极性的流动相的有机基团。也可以选择具有较小键合极性的有机基团作为流动相的极性溶剂。C18色谱柱存在于硅烷化键合（Si-O-Si-C）中。这种键合反应目前最常用。例如，十八烷基三氯硅烷与全多孔硅胶M-Porasil-C18发生反应，产生烷基化学键合成，商品名为M-Bondak-C18。

（4）含碳量即填料中的含碳量。传统的测定技术是将填料加热至碳氢键断裂，再通过测定丢失的重量或形成的二氧化碳来计算含碳量。可通过加大碳键的长度或加大碳键合密度来提高含碳量。含碳量提高，柱的预留值提高。与键合密度相关的色谱行为，也与硅胶的密度和填料的表面积相关，填料的密度越高，填料柱的所需硅胶含量越高，柱的含碳量也越高。如果填料柱的预留行为明显不同，填料柱的含碳量相同，密度不同。因此，单独预测含碳量的色谱行为是不够的。

（5）C18硅烷化试剂是一种大于2nm的大分子，因此它会与相邻硅醇基上的C18硅烷化试剂产生严重的立体阻力。因此，在某些色谱条件下，这些极性硅醇基与碱性化合物相互作用，从而影响峰形拖尾，从而导致大量残留的硅醇基在硅胶表面与硅醇化试剂发生反应，从而影响定量分析结果。通过烷基化学处理，这些问题可以在一定程度上得到解决。烷基化学处理是在键合相上完成的独立反应，以减少硅胶表面的硅醇基。烷基化学处理采用小分子子试剂（如三甲基硅烷），其空间位置阻力远小于C18基团。大多数固定相只有30%的可覆盖的键合位置。据报道，通过一些非常活跃的化学试剂和特殊的反应条件，最高的覆盖率可以达到50%。很好地理解了解硅胶键合相的物理特性，这将有助于在高效液相色谱的反应中选择合适的色谱柱。尽管化学官能团表面上看起来相同，但实际上，不同品牌的C18柱的性能可能会有很大的差异，从而产生不同的分离结果。