【高手解难】色谱双峰怎么破?


    液相分析中,在适当的分析方法条件下,单一化合物的色谱峰应是对称、尖锐的峰型。如果色谱图上出现的是双峰,(1)首先就会推测样品可能含有两个或以上的化合物。(2)如果确保进样的是化学纯的单一物质,应当考虑是否是光学纯的问题,即可能存在手性异构体,这就需采用手性色谱柱进行分析;此外,还需考虑是不是样品不稳定的原因,在该分析条件下迅速降解成两个或以上的化合物。前面两种情况很好解决,毕竟是两个不同的化合物,更换色谱柱、调整分析条件就能将其分开。(3)如果确保进样的是光学纯的单一物质,且该结构在此色谱条件中稳定,仍然出现了双峰,通常被称为色谱双峰,也就是单一物质在色谱图中出现双峰的现象。这种情况非常容易误导分析者的判断,那么色谱双峰该如何判别区分?是什么原因产生,又该如何解决呢?可以从以下几方面思考色谱双峰的产生的原因。

 

1.色谱柱或保护柱污染或塌陷

    这是遇到色谱双峰首先考虑的方面,通常表现为所有色谱峰出现裂分,峰形为前一大峰带后一小峰。主要可能是色谱柱和柱头受堵或塌陷后,柱压发生变化,以至于柱内流速不稳定,导致样品在色谱柱中流动速度不均匀,从而出现了色谱双峰的现象。

    解决方法:将保护柱拿掉,检测色谱双峰是否有改善。如果没有使用保护柱,那就是色谱柱污染或者堵塞(可以通过压力判断),最好的方法是将色谱柱反过来接,用流动相或其它溶剂冲洗、酸洗,将堵在柱头的残留物冲掉,一般情况下可以解决色谱双峰问题。如果依旧不行,那就是强吸附物质污染了色谱柱,则有必要采取色谱柱再生的方法。

 

2.溶剂效应

    这是双峰产生的一个很重要的原因,即样品溶剂与流动相的相容性不好,导致单一物质出现色谱双峰。例如当以中等极性的溶剂作为进样溶剂,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而流动相体系中以强极性水为主,样品进样体积较大时,很可能出现色谱双峰现象。主要是由于样品溶剂与流动相极性相差太大,流动相来不及将进样溶剂稀释,从而引起色谱柱内的环境突然发生较大的变化(即极性不均匀),造成组分洗脱不均匀,导致色谱峰裂分或分叉。对极性比较敏感的化合物容易产生此种情况,通常表现在出峰时间较早的色谱峰裂分,对较晚的色谱峰影响较小,且第二峰比第一峰小,常伴有拖尾。

    解决办法:调整样品的进样溶剂,尽可能与流动相溶剂保持一致;此外,减小样品的进样体积,亦可以减少色谱双峰的发生。

 

3.进样量过载

    通常表现为双峰紧靠在一起,基本上齐高不拖尾。主要是由于样品进样浓度很高或进样体积很大,色谱柱过载,从而出现色谱双峰。如果降低进样量,色谱双峰基本就可以改善。

    解决办法:将样品稀释,同时减少进样体积。

 

4.流动相的酸碱度

    这种情况主要针对弱酸碱性化合物而言。流动相中酸碱pH值不仅与峰拖尾相关,同时也可能出现色谱双峰。通常是第二峰比第一峰小,当出峰时间较早时,两峰高差距较大,第二峰较小,甚至消失;当出峰时间较长时,峰高趋于相等。主要可能是样品在流动相中存在酸碱解离平衡,化合物同时存在已解离和未解离两种分子状态。我们曾采用HPLC制备分离过一类胆汁酸类成分,流动相中加入0.01%甲酸,虽色谱峰不拖尾,但几乎每个胆汁酸类色谱峰裂分成双峰。当提高流动相中甲酸的浓度至0.05%和0.1%,可以明显看到胆汁酸色谱峰的裂分距离缩小,明显的由色谱双峰向单峰融合。

    解决方案:改变流动相中酸碱的pH值,提高酸碱的浓度,在更强的酸碱性条件进行分析。

 

5样品的互变异构

    如果某一物质出现双峰,两峰紧靠且不拖尾,条件稍加变化,如pH、温度改变,双峰消失或减小,例如红霉素等。有的样品采用LC/MS分析时,紫外色谱图虽不易观察到双峰,但质谱总离子流图出现较为明显的色谱双峰。这可能与特定的物质有关,由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在,如酮式和烯醇式互变。

   解决方案:了解样品性质,调整色谱方法,如改变流动相或进样溶剂中pH值、缓冲盐,降低或升高柱温箱的温度等,以减少互变异构的发生,促使样品在分析条件中主要以单一构型为主。

当然,色谱双峰还有不少其它原因,望同行们共同探讨总结。